随着生命科学研究不断深入研究重点正逐渐从“蛋白是否存在”转向“蛋白之间如何相互作用”。越来越多研究表明疾病发生往往并非源于单一分子异常而是来自复杂的分子网络失衡包括蛋白聚集、翻译后修饰、细胞器通讯以及动态信号转导等过程。然而这类生物学事件通常具有几个共同特点丰度低、持续时间短、相互作用弱且容易在样本裂解过程中被破坏。传统免疫共沉淀Co-IP、免疫荧光IF及免疫组化IHC虽然应用广泛但在检测空间邻近关系、弱互作以及原位动态变化时存在明显局限。PLA技术的出现为这一难题提供了新的解决方案。其核心原理是当两个目标分子距离足够接近通常40 nm时与抗体偶联的DNA探针能够发生连接并形成可扩增信号最终通过荧光点实现可视化检测。这种“邻近即信号”的策略使研究者能够在细胞或组织原位环境中更精准地观察真实发生的分子事件。01 弱聚集体也能捕获PLA在早期α-突触核蛋白病理中的高灵敏优势在神经退行性疾病研究中研究者们依赖免疫组化IHC观察“路易小体”这种“大型病理结构”但长期以来一直存在争议“路易小体”是否导致神经元死亡并促进病理在细胞间的传播还是它们代表一种保护性细胞反应。作者将目光聚焦到了早期小聚集体这些小聚集体往往信号弱、不形成包涵体、难以被传统IHC识别于是PLAProximity Ligation Assay开始展现出独特优势。抗体可以决定PLA检测什么作者为了检测非“路易小体”的α- 突触核蛋白早期聚合病理采用MJF-14抗体分别偶联一条独特的单链DNA探针PLUS和MINUS探针。MJF-14这种聚集体特异抗体更倾向于结合低聚体它对低聚体的亲和性比对聚合单体的亲和性高4300倍以上当两个α-突触核蛋白低聚体在空间上邻近 40 nm时形成荧光点。实验发现在PD/DLB患者脑组织中检测到大量远多于传统IHC看到的“路易小体”的PLA信号图1这些PLA信号显示了患者脑部早期病理。作者还发现“路易小体”阳性神经元的PLA信号明显少于邻近的“路易小体”阴性神经元这意味着“路易小体”可能本身不是一种“毒性物质”而是一种保护性的反应将潜在毒性物质隔离。图1MJF-14 PLA呈现出DLB大脑中的大量病理病变Jensen et al., 2024图2LB 阳性神经元的 PLA 信号强度低于邻近的 LB 阴性神经元Jensen et al., 202402 弱修饰也能检测PLA在Tau病理研究中的高灵敏优势研究表明Tau蛋白会异常聚集Tau可能被泛素化在阿尔兹海默症AD患者脑中有大量Tau缠结NFT但在AD患者脑组织里磷酸化Tau蛋白p-tau是否真的和泛素ubiquitin发生了近距离结合/修饰还未可知。人脑组织固定后蛋白互作已经部分被破坏Tau聚集体高度不溶当人脑组织裂解后很多结构丢失且泛素化是弱修饰很难在匀浆水平稳定捕获。PLA生物素标记的共价特性可稳定弱互作避免复合物解离通过累积生物素标记增强检测灵敏度。作者采用p-tauAT8抗体及ubiquitin抗体分别偶联一条独特的单链DNA探针PLUS和MINUS探针当二者足够近就会出现PLA阳性荧光点作者发现人AD脑中p-tau 与 ubiquitin 的PLA信号显著升高即Tau与泛素的近距离关联明显增加且这种PLA信号主要出现在神经纤维缠结NFT、神经纤维网丝及神经元胞体中。图3在non-AD和AD人脑切片中检测到p-tau与泛素形成复合物Romero-Fernandez et al., 202303细胞器互作也能“看得见”PLA解析Treg代谢失衡机制为什么炎症性肠病IBD中的调节性T细胞Treg会“失控”甚至转变成促炎细胞。PLA技术在这里承担了一个非常关键的角色——它帮助作者“看见”了线粒体与内质网之间是否真的发生了近距离相互作用。线粒体-内质网接触位点MAMs决定丙酮酸是否进入线粒体、是否进行氧化磷酸化及Treg代谢是否稳定作者发现Treg里存在大量MAMs尤其是VDAC1与IP3R1连接紧密作者利用PLA技术当VDAC1与IP3R1蛋白邻近时即线粒体与内质网接触时会形成荧光信号。当VDAC1抑制剂、MPC抑制剂破坏接触位点后发现Treg炎症化。作者通过筛选细胞因子发现IL-21明显破坏线粒体-内质网接触位点。于是形成了IL-21 → 线粒体-ER接触减少 → 代谢紊乱 → Treg炎症化的机制链。普通免疫荧光IF分辨率有限只能粗浅地证明两个蛋白共定位很容易出现假阳性膜蛋白的低丰度也很可能导致检测失败而PLA技术不仅可以将蛋白互作信号放大还将可检测到的邻近蛋白距离限制在40nm以内可以通过荧光点确定线粒体与内质网真实接触。PLA技术不是单纯证明VDAC1和IP3R1能结合而是作为“机制链核心证据”回答了“疾病刺激是否改变了细胞器之间的功能联系”。图4通过PLA技术线粒体与内质网的接触区域呈红色Bamidele A et al., 202404 动态解离也能捕获PLA在CaV1.2调控机制研究中的优势经典理论认为β-肾上腺素刺激后激活PKAPKA直接磷酸化CaV1.2通道心肌CaV1.2钙通道活性增强Ca²⁺内流增加心脏收缩加强。但研究人员把CaV1.2上所有已知PKA磷酸化位点全部突变掉β-肾上腺素刺激仍然可以增强钙电流这说明这个调控模型不完成那么β-肾上腺素到底是如何增强CaV1.2活性的作者把关注点放在CaV1.2周围是不是还有关键的调控蛋白CaV1.2本身是多亚基复合物的大型膜通道非常难稳定提取而邻近标记技术能在活细胞内直接给邻近蛋白打标签不依赖稳定结合这就特别适合寻找CaV1.2周围动态调控因子。作者利用邻近标记技术寻找CaV1.2周围的调控蛋白并锁定了一个关键抑制因子Rad。Rad一般紧密结合CaV1.2复合物而β-肾上腺素刺激后PKA磷酸化RadRad从CaV1.2复合物脱离这是一个动态过程这种动态解离很弱且裂解时容易重组出现假阴性所以传统的CO-IP就不适用了作者使用邻近标记技术证明β-肾上腺素刺激Rad-CaV1.2的PLA信号下降说明Rad确实从CaV1.2附近离开了完成了机制的闭环。Rad从CaV1.2解离后通道抑制解除钙流增强。图5邻近蛋白质组学揭示CaV1.2的邻近蛋白 Liu et al., 2024PLA技术之所以近年来受到广泛关注核心在于其兼具“高灵敏度”与“高空间分辨率”两大优势。首先PLA能够有效检测低丰度、弱相互作用及短暂动态变化的分子事件。通过DNA信号扩增机制即使是传统方法难以识别的弱聚集体、低水平翻译后修饰或瞬时蛋白解离也能够被稳定放大并可视化。其次PLA具有更高的空间特异性。普通免疫荧光中的共定位往往只能说明两个蛋白“看起来接近”但PLA将可检测距离限制在约40 nm以内更接近真实生物学互作范围从而有效降低假阳性。此外PLA能够在细胞或组织原位环境下完成检测避免了样本裂解导致的复合物解离、重组及空间结构丢失问题。这使其尤其适用于神经退行性疾病、免疫代谢、膜蛋白调控等复杂体系研究。从早期蛋白聚集病理识别到细胞器接触位点解析再到动态信号调控机制验证PLA正在从“辅助验证工具”逐渐发展为机制研究中的关键证据技术。参考文献Jensen, N.M., Fu, Y., Betzer, C. et al. MJF-14 proximity ligation assay detects early non-inclusion alpha-synuclein pathology with enhanced specificity and sensitivity.npj Parkinsons Dis. 10, 227 (2024).Romero-Fernandez, W., Carvajal-Tapia, C., Prusky, A. et al. Detection, visualization and quantification of protein complexes in human Alzheimer’s disease brains using proximity ligation assay.Sci Rep13, 11948 (2023).Bamidele A, Mishra S. et al. Interleukin 21 Drives a Hypermetabolic State and CD4 T-Cell–Associated Pathogenicity in Chronic Intestinal Inflammation.Gastroenterology,2024; 166, 826-841.e19.Liu, G., Papa, A., Katchman, A.N. et al. Mechanism of adrenergic CaV1.2 stimulation revealed by proximity proteomics.Nature577, 695–700 (2020).